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質譜級賴氨酰肽鏈內切酶
Lysyl Endopeptidase

質譜級賴氨酰肽鏈內切酶新品速遞圖wako.jpg

Lysyl Endopeptidase


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  本產品是質譜分析前處理時常用的蛋白分解酶即賴氨酰肽鏈內切酶,該酶可以特異性切除賴氨酸基團C末端的多肽,可用于蛋白測序分析和Lys-X化合物的酶合成。若同時使用賴氨酰肽鏈內切酶和胰酶,可更好地切斷賴氨酸 基團的多肽,增加多肽的數量。產品已按照使用習慣做成小包裝,是方便使用的冷凍干燥品。20 μg/支可用于100-200個樣品的凝膠內消化。


來源:細菌

外觀:凍干粉(包含2 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH8)

活性:0.03~0.07 AU/vial

分子量:27,000(瓊脂糖過濾),30,000(SDS-PAGE)

溶解性:溶于水或緩沖液

穩定性:溶解于pH值5.0-12.0的Tris緩沖液中,可在4℃穩定保存2年;在pH值6.0-11.0 30℃時能穩定保存,但溫度超過50℃時不穩定。

最適pH值:9.0~9.5

等電點:6.9~7.0 

底物特異性:

可水解底物——Tos-Lys-OMe,Bz-Lys-NH2,Bz-Lys-pNA,Lys-pNA

不可水解底物——Bz-Arg-NH2,Bz-Arg-pNA,Arg-pNA

抑制劑:DFP,PMSF,TLCK



特點


●  高特異性、高蛋白質消化率、適用于蛋白質譜分析

  提高裂解效率、增加肽段數量

  根據使用量特意制備小包裝,方便使用



應用


  分別采用胰蛋白酶(Tp)、賴氨酰肽鏈內切酶 (Lys-C) 和Tp與Lys-C聯用進行膠內酶切的效果比較。

  牛血清蛋白BSA 的條帶(100ng) 通過SDS-PAGE 獲得,然后分別用Tp、Lys-CLys-C+Tp進行酶切,再用MALDI-TOFMS法進行分析。

  這些蛋白酶的實驗效果見下表。


表 1:Tp、Lys-CLys-C+Tp的結果對照

這些結果表明Lys-C酶解的錯誤裂解率最低。Tp酶解時加入Lys-C后,錯誤裂解率有所降低,同時,可以鑒定出更多的多肽。



Tp 

Lys-C

Lys-C+Tp

裂解位點

精氨酸和賴氨酸的C端 

賴氨酸的C端 

精氨酸和賴氨酸的C端

錯誤裂解率

(  錯誤裂解所占比例  )

多(8%)

很少(0%)

少(3%) 

鑒定出的多肽數量 

17

19

22


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胰蛋白酶 (Tp)( 圖 a) 和賴氨酰肽鏈內切酶 (Lys-C)+Tp ( 圖 b) 酶切后的質譜結果對照圖。

Lys-C+Tp酶切后,可以在m/z=2000時得到吸收峰,而單獨的Tp酶切在m/z=2000時沒有吸收峰。該結果表明Lys-C可以提高測序覆蓋度。

 

( 數據由大阪醫療中心和婦嬰健康研究所Y. Wada博士提供 )



賴氨酰肽鏈內切酶


  賴氨酰肽鏈內切酶,最初由Masaki 等人從土壤細菌中分離得到。該酶可以特異性剪切賴氨酸殘基C 末端和S-氨乙基半胱氨酸殘基的肽鍵,用于蛋白測序和Lys-X 化合物的酶催化合成。該酶穩定性高,在4M 尿素或0.1%SDS 溶液中30℃孵育6小時之后,仍然擁有完整的生物活性。


外觀

  凍干粉(包含ca. 10% Tris-HCl buffer,pH 8)

活性

  見包裝

分子量

  27,000(凝膠過濾);30,000 (SDS-PAGE)

溶解性

  易溶于水或緩沖液

最佳pH

  9.0-9.5(酰胺酶的最佳活性pH)

等電點

  6.9-7.0

抑制劑

  DFP、PMSF、TLCK

來源

  細菌

穩定性

 溶于pH 值5.0-12.0 的緩沖液中,可于4℃穩定保存。溶于pH值6.0-11.0的緩沖液中,可于30℃穩

 定保存,但是50℃及以上不穩定。

單位定義

 一單位酰胺酶(AU) 指在30℃ pH 9.5 時每分鐘產生1 μmol對硝基苯胺所需的酶量。

底物特異性

 水解底物:Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

 非水解底物:Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA


實驗方法


1試劑:

A.0.2 mol/L AMP 緩沖液,pH值9.5

溶解4.2g的2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇于150 mL的水中,加入1 mol/L HCl調pH值至9.5,再加水使體積至200 mL。

B.2.5 mmol/L 底物溶液

溶解22.6 mg的N-苯甲酰基-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽于20 mL水中。

C.  2 mmol/L Tris-HCl緩沖液,pH8

溶解0.24 mg的2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇于900 mL水中,加入0.1 mol/L HCl調pH值至8,再加水使體積至1 L。

D. 酶溶液

溶解1vial的賴氨酰肽鏈內切酶于1 mL的溶劑C中,可直接加入。

E.終止溶液

將55 mL水和45 mL乙酸混合均勻。


 

2. 步驟


試劑

檢測樣品

空白對照

A

2.6 mL

2.6 mL

B

0.3 mL

0.3 mL


30℃預培養5分鐘

D

0.1 mL

-

C

-

0.1 mL


立即混合均勻,30℃預培養25分鐘

E

1.0 mL

1.0 mL

 

3. 單位的定義

酰胺酶單位是指30℃ pH9.5時,每分鐘產生1 μmol對硝基苯胺的酶量。

 

AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)

a.    檢測樣品中的吸光度

b.    空白對照中的吸光度

 

膠內酶切的實驗操作流程

  用聚硅酮處理的微量離心管和吸管端防止捕獲任何蛋白。使用質譜分析用凝膠染色試劑盒,例如銀染劑MS試劑盒(產品編號:299-58901)和負凝膠染色MS試劑盒(產品編號:293-57701

1.    電泳分離蛋白質樣品;

2.    從凝膠中切割蛋白質片斷并放入微量離心管;

3.    使凝膠脫色(可使用質譜分析用凝膠染色試劑盒中的脫色溶液);

4.    加入300 μL乙腈到試管里,攪拌器振蕩30分鐘;

5.    去除乙腈,用Parafilm膜覆蓋微量離心管。

6.    Parafilm膜上打出針孔,真空干燥15分鐘;

7.    100 μL 10 mmol/L DTT溶解于100 mmol/L 56℃恒溫1小時。

8.    室溫冷卻后,用等量的50 mM碘乙酰胺溶解于100 mmol/L 暗處恒溫45分鐘并渦旋;

9.    用100 μL 100 mmol/L洗滌凝膠片段10分鐘;

10.  用300 μL乙腈干燥凝膠片段15分鐘;

11.  用100 μL 100 mmol/L溶脹凝膠片段15分鐘;

12.  300 μL乙腈再次干燥凝膠片段15分鐘;

13.  去除液相,真空干燥凝膠片段15分鐘;

14.  100 μL賴氨酸內切酶溶液*在冰水浴中溶脹凝膠片段45分鐘;

  *賴氨酸內切酶稀釋于50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5

15.  去除100 μL賴氨酸內切酶溶液,將凝膠片段放在37 10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5中過夜;

16.  加入50 μL 20mmol/L20分鐘內振蕩凝膠片段3次抽提多肽;

17.  加入5%甲酸/50%乙腈20分鐘內振蕩凝膠片段3次抽提多肽;

18.  如果需要用Speed Vac.濃縮多肽;

19.  ZipTip脫鹽和純化多肽;

20.  如果需要用弱真空濃縮多肽至2 μL

21.  加入基質進行質譜分析。

 

注意:根據細菌的生理和形態特征分類,產品來源為水解無色桿菌,但是最近細菌分類學將這種細菌鑒定為產酶溶桿菌。


保存:暗處-20℃保存

 

規格:20 μg×5 vial



相關產品


產品編號產品名稱包裝應用

Trypsin, from Porcine Pancreas

Mass Spectrometry Grade

豬胰腺胰蛋白酶質譜級別
5×20 μg蛋白質組學
Endoproteinase Asp-N, Sequencing grade
胞內蛋白酶 Asp-N(測序級別)
2 μg用于測序
Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade
胞內蛋白酶 Glu-C(測序級別)
50 μg
V8 Protease [Endoproteinase Glu-C]
V8蛋白酶
2 mg生物化學



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賴氨酰肽鏈內切酶,MS級

產品編號:125-05061

發表文獻


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產品編號 產品名稱 產品規格 產品等級
125-05061 Lysyl?Endopeptidase,?MS?Grade?
賴氨酰肽鏈內切酶,MS級
20?μg×5 質譜級
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